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中國藥品檢驗標準操作規程2010版-微生物限度檢查法全文

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  • 中國藥品檢驗標準操作規程2010版-微生物限度檢查法全文


    一、細菌、霉菌和酵母菌計數

    1 簡述

    細菌、霉菌和酵母菌計數是檢測非規定滅菌制劑及原、輔料受微生物污染程度的方法。也是用于評價生產企業的藥用原料、輔料、設備、器具、工藝流程、環境和操作者的衛生狀況的重要手段和依據。

    細菌、霉菌和酵母菌計數均采用平板菌落計數法,這是活菌計數的方法之一,也是目前國際上許多國家常用的一種方法。以在瓊脂平板上的細菌、霉菌和酵母菌形成一個獨立可見的菌落為計數依據。該法測定結果只反映在該規定條件下所生長的細菌(為一群嗜中溫、需氧和兼性厭氧菌)、霉菌和酵母菌的菌落數。不包括對營養、氧氣、溫度、pH和其他因素有特殊要求的細菌、霉菌和酵母菌。

    一個細菌、霉菌和酵母菌的菌落均可由一個或多個菌細胞生長繁殖而成。因此供試品中所測得的菌落數,實際為菌落形成單位數(colony forming unity,cfu),不應理解為細菌、霉菌、酵母菌的個數。

    2 設備、儀器

    2.1 設備

    2.1.1 潔凈實驗室

    微生物限度檢查應有單獨的潔凈實驗室,每個潔凈實驗室應有獨立的凈化空氣系統。

    2.1.1.1 結構和要求 潔凈實驗室應采光良好、避免潮濕、遠離廁所及污染區。操作間與緩沖間之間應有樣品傳遞艙,出入操作間和緩沖間的門不應直對。潔凈實驗室內應六面光滑平整,能耐受清洗消毒。墻壁與地面、天花板連接處應呈凹弧形,無縫隙,不留死角。操作間內不應安裝下水道。

    潔凈實驗室內的照明燈應嵌裝在天花板內,室內光照應分布均勻,光照度不低于300LX。

    2.1.1.2 溫度、濕度 潔凈實驗室內的溫度應控制在18~26℃,相對濕度最好在40%~60%。

    2.1.1.3 操作間 操作間應安裝空氣除菌過濾層流裝置。潔凈度不應低于10000級,局部潔凈度為100級(或放置同等級凈化工作臺)。操作間或凈化工作臺的潔凈空氣應保持對環境形成正壓,不低于10Pa,操作間與緩沖間也應保持相對正壓,不低于5Pa。操作臺上備有藥物天平,乙醇燈,火柴,乙醇棉球,大、小橡皮乳頭等。

    2.1.1.4 緩沖間 緩沖間內應有洗手盆和無菌衣、帽、口罩、鞋套等。

    2.1.1.5 潔凈級別及檢查方法 通常采用塵粒數及浮游菌數或沉降菌數測定法(參照《醫藥工業潔凈室》(區)懸浮粒子、浮游菌、和沉降菌的測試方法》的現行國家標準)進行潔凈度驗證。

    不同潔凈級別的微粒、浮游菌和沉降菌標準見下表1。



    表l 不同潔凈級別的微粒、浮游菌和沉降菌標準

    潔凈級別

    塵埃數ㄍm3

    浮游菌(個)ㄍm3

    沉降菌(個)ㄍ

    (φ90mm?0.5h)

    微粒直徑≥0.5μm

    微粒直徑≥5μm

    100級

    ≤3,500

    ≤0

    ≤5

    ≤1

    10000級

    ≤350,000

    ≤2000

    ≤100

    ≤3

    100000級

    ≤3,500,000

    ≤20,000

    ≤500

    ≤10


    沉降菌數測定(Ⅱ法)

    潔凈實驗室操作臺消毒擦拭處理后,先啟動層流凈化裝置30min,將備妥的營養瓊脂平板3個(經30~35℃預培養48h,證明無菌落生長)。以無菌方式(或經傳遞箱)移人操作間,置凈化臺左、中、右各1個,開蓋,暴露30min后將蓋蓋上。在30~35℃培養箱內倒置培養48h,取出檢查。3個平板生長的平均菌落數不超過1個。

    有條件的單位,同時應檢查潔凈操作間和凈化工作臺上的浮游菌和微粒數。

    操作問和凈化工作臺要定期檢測其潔凈度,分別應達到10000級和100級。如菌落數或微粒數超標,應清洗過濾系統中的過濾設施,必要時予以更換。

    2.1.1.6 在每次操作前、后用0.1%苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液擦拭操作臺及可能污染的死角,然后啟動層流凈化裝置。

    2.1.2 陽性菌實驗室

    涉及實驗室監控菌株的分離鑒定、樣品陽性菌株的分離分析、方法驗證試驗中的陽性菌操作等實驗活動,應在專門的陽性菌實驗室進行。除另有規定外,陽性菌實驗室應符合國家Ⅱ級生物安全標準,陽性菌實驗室應配備生物安全柜。陽性菌操作不得在供試品檢驗用潔凈實驗室內進行。

    2.1.3 潔凈實驗室、陽性菌實驗室與洗刷、滅菌、消毒、培養及結果觀察的工作間等設施應相對集中,布局合理,避免污染,便于管理。

    2.2 儀器

    2.2.1 恒溫培養箱(30~35℃)、生化培養箱(23~28℃)、微波爐、勻漿儀(3000~8000 r/min)或康氏振蕩器、恒溫水浴、電熱干燥箱(100~300℃)、電冰箱、離心機、離心管、微孔濾膜及薄膜過濾器、蒸汽滅菌器(使用時要進行滅菌效果檢查并應定期請有關部門檢定)。

    菌落計數器、顯微鏡(40×~1500×)、電子天平或藥物天平(感量0.1g),pH計。

    2.2.2 玻璃器皿 錐形瓶(250~300ml、500ml內裝玻璃珠若干)、培養皿(9cm)、量筒(100ml,500m1)、試管(18mm×180mm)及塞、吸管(1m1分度0.0l,10m1分度0.1)、注射器(20ml或30m1)、涂布棒、注射針頭、載玻片、蓋玻片、玻璃消毒缸(帶蓋)、不銹鋼桶(帶蓋)。玻璃器皿用前應洗滌干凈,吸管、量筒不掛水滴,無殘留抗菌物質。吸管口上端距0.5cm處塞入約2cm的適宜疏松棉花,置吸管筒內或牛皮紙袋中。錐形瓶、量筒、試管均應加棉塞或硅膠塞,若用振蕩器制備混懸液時,尚需用玻璃紙包裹瓶塞,以免振蕩時供試液污染瓶塞,再用牛皮紙包扎。玻璃器皿,均于160℃干熱滅菌2h或高壓蒸汽121℃滅菌30min,烘干備用。

    2.2.3 用具 大、小橡皮乳頭(放于干凈帶蓋的容器中,并應定期用70%~75%乙醇溶液浸泡)。無菌衣、帽、口罩、手套(洗凈后配套,用牛皮紙包嚴)滅菌,備用。也可用一次性無菌衣、帽、口罩、手套。

    接種環(白銥金或鎳鉻合金,環徑4~5mm、長度6~10cm)、乙醇燈、乙醇棉球或碘伏棉球、滅菌剪刀或滅菌手術刀和滅菌鑷子、滅菌鋼錐、滅菌稱樣紙、不銹鋼藥匙、試管架、火柴、記號筆、白瓷盤、洗手盆、陶瓦蓋(12cm)、實驗記錄紙等。

    3 試液、稀釋劑和試劑

    3.1試液

    3.1.1 0.1%苯扎溴銨溶液或其他適宜消毒液(供洗手、擦拭操作臺面用)。

    3.1.2 5%石碳酸溶液(配好后裝入玻璃消毒缸內,供消毒帶菌吸管用)亦可選用其他適宜消毒液。

    3.1.3 75%乙醇溶液。

    3.1.4 碘酊或碘伏溶液。

    3.2 稀釋劑和試劑

    稀釋劑配制后,采用高壓蒸汽滅菌法滅菌。

    3.2.1 0.9%無菌氯化鈉溶液(附件二3.1)。

    3.2.2 pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液(附件二3.5)。

    3.2.3 無菌聚山梨酯80氯化鈉?蛋白胨緩沖液(附件二3.4)。

    3.2.4 pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液、pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液(附件二3.3)。

    3.2.5 無菌聚山梨酯80氯化鈉溶液(附件二3.2)。

    3.2.6 無菌0.1%氯化三苯四氮唑溶液(TTC)(附件二2.15)。

    3.2.7 pH7.2無菌磷酸鹽緩沖液(附件二3.3)。

    4 培養基

    4.1 營養瓊脂培養基(附件二5.2)。

    4.2 玫瑰紅鈉瓊脂培養基(附件二5.4)。

    4.3 酵母浸出粉胨葡萄糖(YPD)瓊脂培養基(附件二5.5)。

    培養基制備注意事項:

    4.3.1 采用干燥培養基,按說明配制,應對滅菌后的培養基pH進行校驗。若為自配培養基,原料應挑選,瓊脂凝固力應測定,以確定配制時瓊脂用量。試劑規格應為化學純以上。

    4.3.2 配制的培養基不應有沉淀。如有沉淀,應于溶化后趁熱過濾,滅菌后使用。

    4.3.3 培養基的分裝量不得超過容器的2/3,以免滅菌時溢出。包裝時,塞子必須塞緊,以免松動或脫落造成染菌。

    4.3.4 培養基配制后應在2h內滅菌,避免細菌繁殖。

    4.3.5 滅菌后的培養基應保存在2~25℃,防止被污染,可在3周內用畢;保存于密閉容器中,可在1年內使用。制備好的培養基放置時間不宜過長,以免水分散失及染菌。

    4.3.6 宜采用用水浴或微波爐加熱熔化瓊脂培養基,勿用電爐直接熔化瓊脂培養基,以免營養成份過度受熱而破壞。已熔化的培養基應8h內一次用完,剩余培養基不宜再用。

    4.4 培養基適用性實驗的要求及操作見本操作規程第三部分。

    5 供試品抽樣、保存及檢驗量

    5.1 抽樣

    5.1.1 一般采用隨機抽樣方法,其抽樣量應為檢驗用量(2個以上最小包裝單位)的3~5倍量(以備復試或留樣觀察)。

    5.1.2 抽樣時,凡發現有異?;蚩梢傻臉悠?,應選取有疑問的樣品。機械損傷、明顯破裂的包裝不得作為樣品。

    5.1.3 凡能從藥品、瓶口(外蓋內側及瓶口周圍)外觀看出長螨、發霉、蟲蛀及變質的藥品,可直接判為不合格品,無需再抽樣檢驗。

    5.2 保存

    5.2.1 供試品在檢驗之前,應保存在陰涼干燥處,勿冷藏或冷凍,以防供試品內污染菌因保存條件不妥致死,損傷或繁殖。

    5.2.2 供試品在檢驗之前,應保持原包裝狀態,嚴禁開啟。包裝已開啟的樣品不得作為供試品進行檢查。

    5.3 檢驗量

    5.3.1 所有劑型的檢驗量均需取自2個以上包裝單位(中藥蜜丸需取自4丸、膜劑取4片以上)。

    5.3.2 固體及半固體(黏稠性供試品)制劑檢驗量為10g。

    5.3.3 液體制劑檢驗量為10ml。

    5.3.4 膜劑除另有規定外,檢驗量為100cm2。

    5.3.5 特殊貴重或微量包裝的藥品,檢驗量可酌減。除另有規定外,口服固體制劑不低于3g,液體制劑采用原液者不得少于6ml,采用供試液者不得少于3ml,外用藥品不得少于5g。

    要求檢查沙門菌的供試品,其檢驗量應增加20g或20ml(其中10g或10ml用于陽性對照試驗)。

    6 試驗準備

    6.1 將供試品及所有已滅菌的平皿、錐形瓶、勻漿杯、試管、吸管(1ml、10m1)、量筒、稀釋劑等移至潔凈實驗室內。每次試驗所用物品必須事先做好計劃,準備足夠用量,避免操作中出入潔凈實驗室。編號后將全部外包裝(牛皮紙)去掉。

    6.2 開啟潔凈實驗室空氣過濾裝置,并使其工作不低于30min。

    6.3 操作人員用肥皂或適宜消毒液洗手,進入緩沖間,換工作鞋。再用0.1%苯扎溴銨溶液或其他消毒液洗手或用乙醇棉擦手,穿戴無菌衣、帽、口罩、手套。

    6.4 操作前先用乙醇棉球擦手,再用碘伏棉球(也可用乙醇棉球)擦拭供試品瓶、盒、袋等的開口處周圍,待干后用滅菌的手術鑷或剪將供試品啟封。

    7 供試液的制備

    根據供試品的理化特性與生物學特性,采取適宜的方法制備供試液。所用乳化劑,分散劑、中和劑或滅活劑及其用量應證明是有效的,并對微生物無毒性。供試液的制備若需用水浴加溫時,溫度不應超過45℃,時間不得超過30min。除另有規定外,常用的供試品制備方法如下:

    7.1 液體供試品 取供試品10ml,加pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml,混勻,作為供試液。油劑可加入適量的無菌聚山梨酯80使供試品分散均勻。水溶性液體制劑可用混合的供試品原液作為供試液。

    7.2 固體、半固體或黏稠液供試品 取供試品10g,加pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml,用勻漿儀或其他適宜的方法,混勻,作為供試液。必要時加適量的無菌聚山梨酯80,并置水浴中適當加溫使供試品分散均勻。

    7.3 非水溶性供試品

    7.3.1 軟膏、乳膏劑 取供試品5g(或5m1),加至含溶化的(溫度不超過45℃)司盤805g、單硬脂酸甘油酯3g、聚山梨酯8010g的無菌混合物(溶化,溫度不超過45℃)的燒杯中,即先將燒杯中無菌助溶劑混合物溶化,待溫度不超過45℃時,加入供試品,用無菌玻棒攪拌成團后,分次慢慢加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液至100ml,邊加邊攪拌,使供試品充分乳化,作為1:20供試液。

    7.3.2 油劑 取供試品10ml,加入無菌聚山梨酯80 5~8ml,搖勻,再加入稀釋劑至100ml,作為1:10供試液。

    7.3.3 栓劑 稱取供試品10g,置滅菌錐形瓶中,加適量稀釋劑,置45℃水浴保溫10min,使溶,加入無菌聚山梨酯80 5~8ml,振搖使之乳化,再加稀釋劑(稀釋劑和聚山梨酯80總量為100m1),搖勻,作為1:10供試液。

    7.3.4 膏劑 取供試品10g,加至含20ml無菌十四烷酸異丙酯(制法見附錄ⅪH“無菌檢查法”)和無菌玻璃珠的適宜容器中,必要時可增加十四烷酸異丙酯的用量,充分振搖,使供試品溶解。然后加入45℃的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液100m1,振搖5~10min,萃取,待油水明顯分層,取其水層作為1:10供試液。

    7.4 非水溶性膜劑供試品 一般取樣為100cm2,置滅菌錐形瓶中,加入適量的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液,于45℃±1℃水浴中保溫,浸泡,振搖,以供試品浸液作為l:10供試液。中藥膜劑取100cm2,剪碎,加適量的pH7.0無菌氯化鈉?蛋白胨緩沖液(通常1 cm2加1ml或2m1),浸泡,振搖,以供試品浸液作為1:10供試液。

    7.5 腸溶及結腸溶制劑供試品 取供試品10g,腸溶制劑加pH6.8無菌磷酸鹽緩沖液至100ml,結腸溶制劑加pH7.6無菌磷酸鹽緩沖液至100ml,均置45℃水浴中,振搖,使溶解,作為1:10供試液。

    7.6 氣霧劑、噴霧劑供試品 取規定量供試品,置冰箱冰凍室(-20℃以下)內約1h。取出,迅速消毒供試品容器的開啟部位周圍,用無菌鋼錐在容器上鉆一小孔,在室溫輕輕轉動容器,使拋射劑緩緩全部釋出。用無菌注射器吸出全部藥液,加至適量的稀釋劑(若含非水溶性成份,加適量的無菌聚山梨酯80)中,混勻,取相當于10g或10ml的供試品,再稀釋成1:10的供試液。

    7.7 茶劑供試品 取供試品10g,置滅菌錐形瓶中,加入稀釋劑100ml,振搖2~3min,以滅菌紗布過濾(如為袋泡茶,可直接取2袋,以稱樣結果按1:10加稀釋劑,浸泡30min)。

    以上供試品如吸水膨脹,或黏度過高,可增加稀釋劑的量,制成1:20~1:100供試液。

    7.8 貼膏劑供試品 取規定量供試品,去掉貼劑的保護層,放置在無菌玻璃或塑料片上,粘貼面朝上。用適宜的無菌多孔材料(如無菌紗布)覆蓋貼劑的粘貼面以避免貼劑粘貼在一起。然后將其置于適宜體積并含有滅活劑(如聚山梨酯80或卵磷脂)的稀釋劑中,用力振蕩至少30min,或放置于均質儀均質l0min,或以其他方法制備成供試液。

    7.9 具抑菌活性的供試品

    當供試品具有抑菌活性時,應消除供試液的抑菌活性后,再依法檢查。常用的方法如下:

    7.9.1 稀釋法 取規定量的供試液,加至較大量的培養基中,使單位體積內的供試品含量減少至不具抑菌作用。用平板法測定菌數時,1ml供試液可等量分注多個平皿;控制菌檢查時,可加大增菌培養基的用量。培養基稀釋法適用于抑菌作用不強的制劑。

    7.9.2 離心沉淀法 此方法用于去除供試液中的沉淀物,對于抑菌活性較強的供試品,如供試液中有不溶顆粒、沉淀,取供試液,先以500 r/min,離心3min,取上清液進行試驗,此方法用于細菌計數和控制菌(細菌)檢查。

    7.9.3 薄膜過濾法 見細菌、霉菌和酵母菌計數。

    7.9.4 中和法 凡含汞、砷或防腐劑的供試品,可用相應的試劑鈍化、中和其抑菌活性,制成供試液。

    8 供試液的釋?。?0倍遞增稀釋法)

    8.1 取2~3支滅菌試管,分別加入9ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑(此時操作一般為:左手執試管并將塞打開,傾斜,右手執10ml吸管吸量。切勿在酒精燈火焰的正上方操作,以免火焰將供試液中的菌細胞殺滅)。加稀釋劑后,試管塞應立即塞上。

    8.2 另取1支1ml滅菌吸管吸1:10均勻供試液1ml,加入裝有9ml pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液滅菌稀釋劑的試管中,混勻,即得1:100供試液。以此類推,根據供試品污染程度,可稀釋至1:103、1:104等適宜稀釋級。每遞增l稀釋級,必須另換一支吸管。

    稀釋時,吸管插入第1級稀釋液內不低于液面2.5cm,反復吸吹約10次。吸液時,應先吸至高于吸管上部刻度少許,然后提起吸管,貼于試管內壁調整液量至刻度,吸管移至第2級稀釋管的內壁近液面處(勿接觸液面)緩慢地放出全部供試液(吸管內應無黏附或殘留液體),然后將吸管放入消毒液缸內。

    9 計數方法驗證

    由于某些供試品具有抗菌活性,在建立測定方法或原測定法的檢驗條件發生改變時,可能影響檢驗結果的準確性,必須對供試品的抑菌活性及測定方法的可靠性進行驗證。對各試驗菌的回收率應逐一進行驗證。

    9.1 驗證用菌株大腸埃希菌Escherichia coli[CMCC(B) 44102],金黃色葡萄球菌Staphylococcus aureus[CCMCC(B) 26003],枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis[CMCC(B) 63501],白色念珠菌Candida albicans[CMCC(F) 98001],黑曲霉菌Aspergillus niger[CMCC(F) 98003]。

    菌液制備 接種大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌的新鮮培養物至營養肉湯培養基中或營養瓊脂培養基上,培養18~24h;接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊脂培養基上,培養24~48h。上述培養物用0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含菌數為50~100cfu的菌懸液。接種黑曲霉的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂斜面培養基上,培養5~7天,加入3~5ml含0.05%(ml/m1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,將孢子洗脫。然后,用適宜方法吸出孢子懸液至無菌試管內,用含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液制成每1ml含孢子數50~l00cfu的孢子懸液。

    菌懸液制備后,若在室溫下放置應在2h內使用,若保存在2~8℃的菌懸液可以在24小時內使用。黑曲霉菌的孢子懸液保存在2~8℃,可在驗證過的貯存期內替代對應量的新鮮孢子懸液使用。

    9.2 驗證方法 驗證試驗分4組,至少應進行3次獨立的平行試驗,并分別計算供試品組和對照組試驗的菌回收率。

    9.2.1 供試品組 取最低稀釋級的供試液,按每1ml供試液加入50~l00cfu試驗菌,按菌落計數方法測定其菌數。平皿法計數時,取試驗菌液、供試液各1ml分別注入平皿中,立即傾注瓊脂培養基;薄膜過濾法計數時,取供試液2ml過濾,沖洗液沖洗,并在最后一次的沖洗液中加入試驗菌。

    9.2.2 活菌組 取上述試驗菌液,測定其加入的試驗菌菌數。

    9.2.3 供試品對照組 取最低稀釋級的供試液1ml,按菌落計數方法測定供試品本底菌數。

    9.2.4 稀釋劑對照組 為考察供試液制備過程中對微生物影響的程度,可用相應的稀釋液替代供試品,加入試驗菌,使最終菌濃度為每1ml含50~l00cfu,按供試品組的供試液制備方法和菌落計數方法測定其菌數。


    9.3 結果判定對照組的菌回收率均應不低于70%。若供試品組的菌回收率均不低于70%,則可按該供試液制備方法和菌落計數法測定供試品的細菌、霉菌及酵母菌數;若任一次試驗中供試品組的菌回收率低于70%,應建立新的方法,消除供試品的抑菌活性,并重新驗證。

    9.4 驗證試驗可與供試品的細菌,霉菌及酵母菌計數同時進行。

    9.5 注意事項

    9.5.1 所用標準菌種的傳代次數不得超過5代。以冷凍干燥的原始菌種開啟后轉種培養,其培養物為第一代。

    9.5.2 黑曲霉菌的菌液制備 將黑曲霉菌接種至改良馬丁瓊脂斜面培養基上,于20~25℃培養5~7天,使大量的孢子產生。加入3~5ml含0.05%(ml/m1)聚山梨酯80的0.9%無菌氯化鈉溶液,用無菌玻棒或接種環輕輕將孢子洗脫。然后可用一支l0ml無菌球形毛細吸管,其管口用無菌棉花或紗布包扎且能過濾菌絲的裝置,吸出孢子懸液至無菌試管內,將孢子懸液稀釋至每毫升含50~l00cfu。

    9.5.3 做試驗菌的回收率試驗時,加入菌量50~l00cfu為宜。加菌量過多,如薄膜法,菌落擁擠,則不好計數;加菌量過少,則誤差較大。

    9.5.4 進行驗證試驗時,若因沒有適宜的方法消除供試品中的抑菌作用而導致微生物回收的失敗,應采用能使微生物生長的更高稀釋級供試液進行方法驗證試驗。此時更高稀釋級供試液的確認要從低往高的稀釋級進行,但最高稀釋級供試液選擇應根據供試品應符合的微生物限度標準和菌數報告規則,如供試品應符合的微生物限度標準是1克細菌數不得過1000cfu,那么最高稀釋級是1:10?3。

    若采用允許的最高稀釋級供試液進行驗證試驗還存在一株或多株試驗菌的回收率達不到要求,那么應選擇回收情況最接近要求的方法進行供試品的檢測。如某種產品對某試驗菌有較強的抑菌性能,采用薄膜過濾法的回收率為40%,而采用培養基稀釋法的回收率為30%,那么應選擇薄膜過濾法進行該供試品的檢測。在此情況下,生產單位或研制單位應根據原輔料的微生物質量、生產工藝及產品特性進行產品的風險評估,以保證檢驗方法的可靠性,從而保證產品質量。

    10 檢查法

    10.1 平皿法

    10.1.1 在上述進行10倍遞增稀釋的同時,以該稀釋級吸管,吸取該稀釋級供試液各1ml至每個直徑90mm的滅菌平皿中,或從高稀釋級至低稀釋級吸液時可用1支吸管吸供試液各1ml至每個滅菌平皿中。每一稀釋級每種培養基至少注2~3個平皿(一般為左手執平皿,將蓋半開,右手執吸管),注皿時,將1ml供試液慢慢全部注入平皿中,管內無殘留液體,防止反流到吸管尖端部。

    10.1.2 陰性對照 待各級稀釋液注皿完畢后,用1支1ml吸管吸取試驗用稀釋劑(pH7.0氯化鈉-蛋白胨緩沖液)各1ml,分別注入4個平皿中。其中2個作細菌數陰性對照;另2個作霉菌、酵母菌數陰性對照,如另用YPD瓊脂測定酵母菌數時,則再增加2個平皿作酵母菌數陰性對照。

    10.1.3 傾注培養基

    將預先配制好的細菌計數用的營養瓊脂培養基;霉菌、酵母菌計數用的玫瑰紅鈉瓊脂培養基;含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養基(霉菌)和YPD瓊脂培養基(酵母菌)熔化,冷至約45℃時,傾注上述各個平皿約15ml,以順時針或反時針方向快速旋轉平皿,使供試液或稀釋液與培養基混勻,蓋上陶瓦蓋,或半蓋蓋,除去冷凝水后,再移去陶瓦蓋后,蓋上平皿蓋置操作平臺上待凝。在旋轉平皿時切勿將培養基濺到皿邊及皿蓋上。

    10.1.4 培養

    細菌計數平板倒置于30~35℃培養箱中培養3天。霉菌、酵母菌計數平板倒置于23~28℃培養箱中培養5天,必要時延長至7天。逐日觀察菌落生長情況,點計菌落數。

    10.1.5 菌落計數

    10.1.5.1 一般將平板置菌落計數器上或從平板的背面直接以肉眼點計,以透射光襯以暗色背景,仔細觀察。勿漏計細小的瓊脂層內和平皿邊緣生長的菌落。注意細菌菌落、霉菌菌落和酵母菌菌落之間,以及菌落與供試品顆粒、培養基沉淀物、氣泡、油滴等的區別。必要時用放大鏡或用低倍顯微鏡直接觀察,或挑取可疑物涂片鏡檢。

    10.1.5.2 供試品如為微生物制劑,應將有效微生物菌落排除,不可點計在細菌、霉菌和酵母菌數內。排除的方法需按該制劑微生物品種而定,并須觀察菌落特征及染色形態。

    10.1.5.3 供試品稀釋液常含有不溶性原料、輔料,培養基注皿后亦可能產生沉淀物,經過培養后有時形成數量很多的有形物,且難與菌落相區別。為了有利于菌落計數,可在操作時將適宜稀釋級的供試液多增加注皿(1~2個平皿)。注皿后不經培養而放置于冰箱(勿結凍)中。在計數菌落時作為對照?;蛴煤琓TC營養瓊脂注皿,經培養后該培養基生長的菌落為紅色,襯于白色背景上易于點計細菌菌落和區分其他有形物。有些軟膏等非水溶性供試品,經營養瓊脂注皿后呈乳白色,培養后生長的菌落不易辨認和點計,為防止這種情況,也可用含TTC營養瓊脂注皿。TTC的用量應以不抑制微生物生長為宜,通常使用的濃度為0.001%。

    10.1.5.4 若平板上有2個或2個以上菌落重疊,肉眼可辨別時仍以2個或2個以上菌落計數;若平板生長有鏈狀或片狀、云霧狀菌落,菌落間無明顯界線,一條鏈、片作為一個菌落計,但若鏈、片上出現性狀與鏈、片狀菌落不同的可辨菌落時,仍應分別計數,若生長蔓延的較大的片狀菌落或花斑樣菌落,其外緣有若干性狀相似的單個菌落,一般不宜作為計數用。

    10.1.5.5 菌落生長呈蔓延趨勢者,細菌需在24h,霉菌需在48h做初步點計(點計霉菌菌落時,輕輕翻轉平板,勿反復翻轉,否則使早期形成的孢子散落在平板的其他部位,又萌生新的霉菌菌落,導致計數誤差)。

    10.1.5.6 在培養3天點計細菌,培養5天點計霉菌時,如菌落極小,不易辨認,細菌計數可延長培養時間至5天;霉菌及酵母菌計數可延長培養時間至7天,再點計菌落數。

    10.1.5.7 對有異議的供試品以YPD培養基作酵母菌計數時,可培養至1周再點計菌落數。

    10.1.5.8 含蜂蜜、王漿液體制劑用玫瑰紅鈉瓊脂培養基點計霉菌數,YPD瓊脂培養基點計酵母菌數。兩者合并計數。

    10.1.5.9 在特殊情況下,若營養瓊脂培養基上長有霉菌和酵母菌、玫瑰紅鈉瓊脂培養基上長有細菌,則應分別點計霉菌和酵母菌、細菌菌落數。然后將營養瓊脂培養基上的霉菌和酵母菌數或玫瑰紅鈉瓊脂培養基上的細菌數,與玫瑰紅鈉瓊脂培養基中的霉菌和酵母菌數或營養瓊脂培養基中的細菌數進行比較,以菌落數多的培養基中的菌數為計數結果。

    10.1.6 菌數報告規則

    10.1.6.1 宜選取細菌、酵母菌平均菌落數小于300cfu、霉菌菌落數平均數小于100cfu的平板計數作為菌數報告(取兩位有效數字)的依據。

    10.1.6.2 當僅有1個稀釋級的菌落數符合上述規定,以該級的平均菌落數乘以稀釋倍數報告菌數;當有2個或2個以上稀釋劑的菌落數符合上述規定,以最高的平均菌落數乘以稀釋倍數值的值報告。

    10.1.6.3 如各稀釋級的平板均無菌落生長,或僅最低稀釋級的平板有菌落生長,但平均茵落數小于1時,以小于1乘以最低稀釋倍數報告菌數。

    菌數報告規則示例見下表2。

    表2 菌數報告規則示例

    菌數報告

    規則示例

    各稀釋級(供試液1mlㄍ皿)平均菌落計數(cfu)

    菌數報告數

    (cfuㄍg,ml,10cm2)

    原液

    1:10(-1)

    1:102(-2)

    1:103(-3)

    1

    ——

    64

    8

    2

    640

    2

    ——

    420

    64

    8

    6400

    3

    ——

    不可計

    420

    64

    64000

    4

    ——

    0

    0.5

    0

    <100

    5

    ——

    ——

    0

    0

    <100

    6

    ——

    0

    0

    0

    <10

    7

    0

    0

    0

    ——

    <1


    10.2 薄膜過濾法

    10.2.1 薄膜過濾法主要起到富集微生物、分離去除樣品中對微生物生長產生干擾的因素的作用,可以有效提高檢查結果的靈敏度和可靠性,是近年來微生物檢查領域中日益廣泛應用的一種技術手段。

    10.2.2 薄膜過濾法采用的濾膜孔徑應不大于0.45um。濾膜直徑一般為50mm,為便于計數,以及減輕供試液堵塞濾膜的情況,在便于操作的前提下,可以選用直徑更大的濾膜或薄膜過濾器。采用不同直徑的濾膜,沖洗量應進行相應的調整。選擇濾膜材質時應保證供試品及其溶劑不影響微生物的充分被截留。濾器及濾膜使用前應采用適宜的方法滅菌。使用時,應保證濾膜在過濾前后的完整性。

    10.2.3 水溶性供試液過濾前先將少量的沖洗液過濾以潤濕濾膜。油類供試品,其濾膜和過濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率,應注意保持供試品溶液及沖洗液覆蓋整個濾膜表面。供試液經薄膜過濾后,若需要用沖洗液沖洗濾膜,以濾膜直徑為50mm的濾膜計,每張濾膜每次沖洗量不超過100ml,總沖洗量不得超過1000ml;其他直徑的濾膜及薄膜過濾器可按膜面積比例調整,總的原則是避免大體積、過高流速的沖洗造成濾膜上的微生物受損傷。

    10.2.4 由于供試液中一些不能通過濾膜的顆粒存在,常常造成濾膜堵塞、壓力升高,嚴重情況時可能發生過濾裝置炸裂造成安全事故或實驗室污染;也可能發生由于壓力過大濾膜開裂或濾膜孔徑變大,造成濾膜對微生物的過濾截留失敗。所以,實際操作中應考慮對薄膜過濾中的壓力控制和設備的安全性,設置一定的安全壓力限度,例如濾膜兩側壓差不得過50psi。具體壓力限度應根據具體薄膜過濾裝置及濾膜確定。

    10.2.5 采用適當方法去除供試液中的顆粒(前提是不能影響微生物的回收率)、適當增加薄膜面積或降低過濾液體流速可以有效降低濾膜兩側的壓力差。

    10.2.6 取相當于每張濾膜含1g、1ml或10cm2供試品的供試液,加至適量的稀釋劑中,混勻,過濾。若供試品每1g、1ml或10cm2所含的菌數較多時,可取適宜稀釋級的供試液1ml,過濾。用pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液或其他適宜的沖洗液沖洗濾膜,沖洗方法和沖洗量見10.2.3及10.2.4。沖洗后取出濾膜,菌面朝上貼于營養瓊脂培養基或玫瑰紅鈉瓊脂培養基或酵母浸出粉胨葡萄糖瓊脂培養基平板上培養。每種培養基至少制備一張濾膜。濾膜貼于平板上時不得有空隙或氣泡,否則影響微生物生長。

    10.2.7 貼膏劑宜采用薄膜過濾法進行細菌、霉菌及酵母菌計數。

    10.2.8 陰性對照試驗 取試驗用的稀釋液1ml照上述薄膜過濾法操作,作為陰性對照。陰性對照不得有菌生長。

    10.2.9 培養和計數 培養條件和計數方法同平皿法,每片濾膜上的菌落數應不超過100cfu。

    10.2.10 菌數報告規則 以相當于1g、1ml或10cm2供試品的菌落數報告菌數;若濾膜上無菌落生長,以<1報告菌數(每張濾膜過濾1g、1ml或10cm2供試品),或<1乘以最低稀釋倍數的值報告菌數。

    10.3 培養基稀釋法

    取低稀釋級供試液(原液或1:10供試液或其他供試液)2份,每份各1ml,分別注入平皿中(每皿0.5ml、0.2ml或<0.2m1),每1個平皿傾注營養瓊脂培養基約15ml,混勻,凝固后,倒置培養,計數。

    每份供試液所加注平板點計的菌落之和,即為每lml菌落數,共得2組數據。以2份低稀釋級供試液菌落數的平均值乘以稀釋倍數報告。

    10.4 結果報告

    10.4.1 菌落數在100以內時,按實有數據報

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